Metoda PCR ali verižna reakcija s polimerazo je deset let po odkritju svojemu "očetu", ameriškemu biokemiku, Karyju Mullisu leta 1993 prinesla Nobelovo nagrado za kemijo. Z metodo PCR je namreč mogoče klonirati DNK, ne da bi za to potrebovali žive celice, kar pred tem praktično ni bilo mogoče.

Metoda CRISPR je svojo slavo doživela veliko pozneje. Čeprav so bile tandemske ponovitve, prekinjene s kratkimi unikatnimi zaporedji DNK, v bakterijah odkrite že leta 1987, pa so njihovo funkcijo in mehanizem nastanka odkrili kar nekaj pozneje. Natančneje, 20 let pozneje. Leta 2007 je znanstvenik danskega prehranskega velikana Danisca ugotovil, da gre za del bakterijskega obrambnega mehanizma pred virusi.

A pravi preboj je prišel šele v letu 2011. Tedaj je zagonsko podjetje Caribou ameriške raziskovalke Jennifer Doudna z univerze Berkeley ter francoske raziskovalke, trenutno dela na nemškem inštitutu Maxa Plancka, Emmanuelle Charpentier z do takrat še ne videno lahkoto na specifičnem mestu z metodo CRISPR-Cas9 spremenilo genetski zapis bakterij. Zgodba tu sicer doživi še zanimiv pravni zasuk. Vnela se je vročična patentna bitka med Doudnovo oz. univerzo Berkeley na eni strani ter Feng Džangom s harvardskega/MIT-jevega inštituta Broad na drugi strani glede tega, kdo je dejansko bil prvi, ki je prijavil patent za to vroče biotehnološko blago. Tu je govor o milijardah evrov, a to ni bistvo te zgodbe.

Od leta 2012, ko sta bili na temo CRISPR-Cas9 objavljeni dve ključni študiji, je začela uporaba nove metode eksponentno naraščati. Če je bilo še leta 2012 prijavljenih nekaj deset patentov, ki so vključevali besedo CRISPR, je ta številka v naslednjih dveh letih poskočila na skoraj 200, lani pa je CRISPR po izboru ugledne znanstvene revije Science že dobil laskavi naslov za preboj leta. Priznanje je torej prišlo veliko prej kot za Mullisov PCR.

Kako deluje?
In kaj sploh je CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats – uradnega slovenskega imena za zdaj še ni, na fakulteti za kemijo pa uporabljajo prevod: gruče enakomerno prekinjenih kratkih palindromnih ponovitev, op. a.)? Kot že rečeno, gre za mehanizem, ki ga bakterije uporabljajo v obrambi pred virusi. Marko Petek z Nacionalnega inštituta za biologijo (NIB) nam je pojasnil, da imajo bakterije več različic tega mehanizma, vezane pa so na različne proteine Cas (CRISPR associated protein oz. s CRISPR-jem povezani protein op. p.) , se pravi proteine s podobno funkcijo.

"V bakterijskem genomu so neke določene ponovitve, za katere najprej niso vedeli, kaj pomenijo, med njimi pa so odkrili specifična zaporedja, ki so pravzaprav iz virusnega DNK-ja. Pozneje so ugotovili, da je te koščke virusnega DNK-ja v svoj DNK s pomočjo mehanizma CRISPR-Cas9 vstavila bakterija. Cas9 bakteriji namreč omogoča, da svoj DNK razreže na zelo specifičnem mestu in nato na tem mestu vstavi več koščkov virusnega DNK-ja. Na ta način bakterija lahko ob prihodnji okužbi z istim virusom tega prepozna. Lahko rečemo, da bakterija sama razvije svoje cepivo," je pojasnil Petek.

Jasno, ko so bile enkrat skrivnosti mehanizma znane, se pravi, da se ga da uporabljati tudi na celicah drugih organizmov, so raziskovalci hitro dojeli, da gre za zelo močno orodje, ki bi ga lahko uporabili pri genskem inženiringu rastlin, živali in tudi ljudi.

Sam postopek pa poteka nekako takole – potrebna sta protein Cas9 ter kratka, 20 nukleotidov dolga, molekula "vodeče" ribonukleinske kisline (RNK, v angleškem jeziku gRNA oz. guide RNA – to guide v angleščini pomeni voditi, op. p.). Molekulo RNK se na računalniku najprej načrtuje tako, da bo našla točno določeno mesto na genomu. Ko je računalniški načrt narejen, se molekulo še kemijsko sintetizira. Novo sintetizirano molekulo RNK je potem treba še spraviti v celico, za kar obstaja več načinov, najpreprosteje z elektroporacijo DNK-ja, gRNK in Cas9, lahko pa z dostavnimi sistemi npr. z nanodelci ali gensko spremenjenimi virusi ali bakterijami, odvisno, ali gre za živalsko ali rastlinsko celico, je naštel Petek. Ko sta Cas9 in RNK enkrat dostavljena v celico, Cas9 s pomočjo gRNA najde specifično mesto na genomu, razreže dvojno vijačnico DNK-ja na tem mestu in bodisi vstavi nov gen bodisi izreže neželenega.

Cena, učinkovitost, enostavnost
Roko na srce, podobno je bilo mogoče doseči že pred CRISPR-Cas9. Pred leti so se znanstveniki navdušili nad encimi, ki so jih poimenovali cinkovi prsti in ki so prav tako zmožni poljubno urejati genom. Pomanjkljivost? Cena nekaj tisoč evrov in zahtevna izdelava. In tu se skupaj z enostavnostjo, učinkovitostjo, nižjo ceno in zmožnostjo ciljne uporabe skriva revolucionarnost metode CRISPR-Cas9. Znanstveniki lahko zdaj svojo želeno molekulo gRNK enostavno naročijo prek spleta, vse druge sestavine pa kupijo naravnost "s police". Končna cena: okoli 200 evrov.

Večina znanstvenih razprav glede uporabe tega orodja se tako zdaj vrti okoli možnosti, ki jih vidijo pri zdravljenju bolezni in urejanju genov v zarodkih, v enem od svojih člankov piše spletni Nature.

Izjemne možnosti uporabe
A to je le ena od možnosti, ki jih ponuja, poroča Nature. Zaradi nizke cene, enostavne uporabe ter ciljnega delovanja se lahko znanstveniki osredotočijo na posamezne dele DNK-ja in ugotavljajo, kaj počnejo in kje posamezni geni sploh so. Že to, da pri razrezu in popravilu DNK-ja lahko pride do napak, je za raziskovalce včasih darilo, saj lahko neposredno preverjajo posledice napačnega popravila na posameznih odsekih DNK-ja.

V letu 2012 pa so raziskovalci izdelali Cas9 protein, ki še vedno najde želeno mesto na genomu in se nanj veže, vendar so "zlomili škarje" in proteinu preprečili, da razreže DNK. S takim Cas9 se lahko proteinom, ki omogočajo izražanje genov, onemogoči, da bi na določenem mestu prepisali DNK v RNK, kar ima za posledico utišanje gena na tistem mestu.

Če prevrtimo nekaj popravkov naprej, ko so Cas9 vezali na drug protein, ki aktivira izražanje genov, pa smo že na stopnji, ko so raziskovalci imeli na voljo mehanizem za prižiganje in ugašanje genov. Ko so čez nekaj časa ugotovili, da lahko to počnejo z več geni hkrati, so se hkrati zavedali, da imajo v rokah orodje za grajenje biovezij. Ta bi bila, recimo, mogoče sprogramirati tako, da bi celični metabolizem proizvajal biogoriva, piše Nature. Poleg tega so raziskovalci že razvili različico, kjer gene lahko utišajo ali izrazijo samo začasno, npr., če ustrezne proteine oz. "stikala" v celici izpostavijo modri luči.

Obetavno področje za uporabo novega genetskega orodja je tudi epigenetika. Epigenetika se večinoma ukvarja z molekulami, ki se vežejo na določen odsek DNK in s tem povzročijo "vklop" ali "izklop" prepisovanja posameznih genov. Vse celice imajo sicer enak DNK, vendar so molekule, ki se vežejo nanj, odgovorne za to, ali se bo celica preobrazila v kožno, možgansko, kostno … celico. Doslej pa znanstveniki, ki razvijajo področje epigenetike, niso imeli orodja, tako kot genetiki, ki bi jim omogočalo neposredno spreminjati te kemične označevalce na posameznih odsekih DNK-ja, posledično pa niso mogli proučevati, ali imajo posamezne molekule dejansko kakšen učinek. Zdaj lahko s pomočjo nedejavnega proteina Cas9 dostavijo encime, ki epigenetsko preoblikujejo DNK, na želeno mesto v genomu in gledajo, kaj se zgodi. Raziskave so sicer šele na začetku, a raziskovalci so že na pragu novih odkritij.

Tu so še raziskave nekodirajočega dela DNK-ja, ki predstavlja kar 98 odstotkov našega DNK-ja. Ker ne kodira proteinov, je dolgo veljalo prepričanje, da je ta del odvečen in ne počne ničesar. Izsledki raziskav preteklih let pa kažejo, da bi nekodirajoči del lahko imel pomembno vlogo v mnogih celičnih procesih in CRISPR-Cas9 je kot nalašč za ugotavljanje vloge teh procesov.

Zaradi določenih omejitev metode s proteinom Cas9 znanstveniki zdaj prečesavajo kraljestvo bakterij, da bi našli sorodnike Cas9, ki bi lahko postopek še poenostavili in ga nadgradili. Eno izmed teh odkritij je protein Cpf11. V nasprotju s Cas9 za razrez DNK potrebuje le eno molekulo RNK, hkrati pa DNK-ja ne razreže na obeh straneh na istem mestu, temveč reže malce pod kotom in na več mestih hkrati. To prinaša povsem nove možnosti manipulacije in hkrati poenostavlja delo, saj se pri metodi CRISPR-Cas9 nov košček DNK lahko vstavi v napačni orientaciji, medtem ko pri Cpf11 to ni mogoče, ker je jasno razvidno, kateri, pod kotom odrezani strani, je treba spojiti.

Znanstvena sfera pa ni edina, ki je CRISPR-Cas9 z odprtimi rokami sprejela v svoje vrste. Gospodarstvo ni nič kaj zaostajalo. Ameriški kemijski velikan DuPont z novim orodjem že razvija več deset novih proizvodov, med njimi nov tip koruze, riža, soje, gob in žita. Za proizvajalce gensko spremenjenih vrst je CRISPR-Cas9 po drugi strani skorajda mana z neba. Veliko odpora javnosti proti gensko spremenjenim organizmom je zaradi medsebojnega kombiniranja genov različnih vrst. Da cene registriranja in lansiranja takšnih proizvodov na trg niti ne omenjamo. Velika bioinženirska podjetja pa zdaj lahko razvijajo nove proizvode zgolj z manipulacijo genov, ki so neki rastlini lastni. In daleč od tega, da bi se ustavili zgolj pri rastlinah. Raziskovalci so v preteklih letih že začeli razvijati govedo brez rogov, miniaturne pujse in proti bolezni odporne koze.

Tudi človek tu ni izjema. Kitajska je pred dobrim tednom napovedala, da bo avgusta začela prve poskuse z metodo CRISPR-Cas9 na izoliranih človeških celicah (bolnikom v zadnjem stadiju pljučnega raka bodo odvzeli imunske celice, jih s to metodo spremenili in nato znova vbrizgali), poskuse na človeških zarodkih je odobrila Velika Britanija, z njimi pa konec leta začnejo tudi v ZDA.

Vsako orodje ima svoje pomanjkljivosti
Izjemno živahno dogajanje torej zgolj v razdobju štirih let. Ampak, tako kot razvoj na vseh drugih področjih, je tudi biotehnološki razvoj vedno korak pred zakonskim nadzorom in javnim mnenjem. Zaradi poseganja v gradnike življenja je ta veja znanosti še posebej pod pritiskom javnosti in zakonodajalcev, saj odpira nemalo etičnih dilem o osnovnih vidikih življenja. Obenem se porajajo strahovi o dizajnerskih otrocih, himerah in povzročanju nepredvidljivih in morda nepovratnih posledic v naravnih ekosistemih. Tako se v primeru, kjer agresivno širijo genetsko spremenjene komarje, ki ne morejo prenašati malarije, porajajo skrbi, da bi lahko ti postali dovzetnejši za kakšne druge viruse.

Zato zakonodaja še vedno zelo tesno regulira gensko spreminjanje rastlin, živali in človeka. Poskusi, ki jih je dovolila Velika Britanija na človeških zarodkih, bodo npr. lahko trajali zgolj sedem dni od oploditve, zarodke pa bodo po 14 dneh uničili.

In glede na število neznank, ki jih CRISPR-Cas9 prinaša s seboj, previdnost ni odveč. Keith Joung s splošne bolnišnice Massachusetts v Bostonu je v svojih raziskavah ugotovil, da se pri uporabi te metode dogajajo tudi rezi v DNK na mestih, kjer to ni bilo predvideno. Pogostost takih rezov sicer od celice do celice močno niha in laboratoriji so poročali o frekvenci mutacij na neciljanih mestih v razponu od 0,1 do več kot 60 odstotkov. Že majhna frekvenca tovrstnih pojavov pa bi lahko bila nevarna, če povzroči celično rast in pozneje raka, je Joung povedal za Nature. Vsekakor torej podatek, ki zahteva dodatne raziskave.

Petek: Navdušenje je upravičeno
Treba se je torej zavedati, da je CRISPR-Cas9 zgolj orodje, poudarja Petek, in to zelo mlado, zato se bo s časom izboljševalo. "Teh 20 nukleotidov je resda dokaj specifičnih, ampak se kljub temu v velikih genomih lahko pojavljajo večkrat," Petek pojasni razloge, zakaj se rezi DNK-ja zgodijo tudi na neželenih mestih "gRNK se pod določenimi pogoji lahko veže na mesta, ki niso popolnoma komplementarna tistim na DNK, pa se bo cepitev vseeno zgodila. Kar pomeni, da imamo tu slab dizajn. Poleg tega mora imeti DNK v bližini cepitvenega mesta točno določeno zaporedje, ki pa ga nimajo čisto vsi določeni geni. Se pravi, da s Cas9 tudi ne moremo spreminjati čisto vseh genov," je opozoril. Resda pa je to pomanjkljivost zgolj proteina Cas9 in novi sistemi že povečujejo natančnost in število tarčnih mest na genomu, je dodal. Tako so že razvili sistem FokI-Cas9, ki potrebuje dva točno določena proteina, če naj se DNK razreže.

Metodo CRISPR-Cas9 zaradi njene učinkovitosti zdaj za gensko spreminjanje rastlin uvajajo tudi na Oddelku za biotehnologijo in sistemsko biologijo na NIB-u, kjer je zaposlen Petek. In zakaj je niso uvedli že prej? Iz čisto preprostega razloga: "Kakor koli se že sliši enostavno, ni tako zelo. Obstajajo druge metode, ki so že uveljavljene in delujejo tudi na nemodelnih rastlinah, kot je krompir. Novo metodo pa je treba vseeno uvesti v laboratorij. In pri rastlinah je to dokaj zapleteno, saj dostava teh kompleksov ni preprosta. Poleg tega smo doslej dokaj uspešno uporabljali metode z nespecifičnim vstavljanjem genov, kjer je cena še vedno nižja kot pri CRISPR-Cas9."

Metoda torej ima svoje omejitve, ki pa se bodo z razvojem počasi začele zmanjševati in po Petkovem mnenju kljub vsemu upravičuje vse navdušenje nad njo, saj je močno poenostavila in pocenila ciljano gensko manipulacijo. Vendar je do poskusov na ljudeh še daleč, saj je velika prepreka vnos v celico v človeškem telesu, poleg že omenjenih nepoznanih dejavnikov, ki sovplivajo, pa jih še ne poznamo.